लेख साझाकरण|इज़ोटेर्मल रीबॉम्बिनेज पोलीमरेज़ प्रवर्धन का उपयोग करके घास झींगा में हेपेटोपैनक्रेटिक माइक्रोस्पोरिडियम का तेजी से पता लगाना (एमआईआरए)

चीन के मीठे पानी के एक्वाकल्चर उद्योग में घास झींगा एक महत्वपूर्ण आर्थिक प्रजाति है। हालांकि, हाल के वर्षों में,हेपेटोपैन्क्रीटिक माइक्रोस्पोरिडियम(ईएचपी), झींगा के हेपेटोपेंसरस को संक्रमित करने वाले एक परजीवी ने उद्योग को गंभीर रूप से प्रभावित किया है। चूंकि इस बीमारी का इलाज करने के लिए वर्तमान में कोई प्रभावी दवा या टीका नहीं है, इसलिए इसके प्रसार को रोकने के लिए तेजी से और सटीक पता लगाना महत्वपूर्ण है।

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Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang Ge, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie। Litopenaeus Vannamei में हेपेटोपेनक्रेटिक माइक्रोस्पोरिडियम का अलगाव और रूपात्मक अवलोकन। जर्नल ऑफ़ फिशरी साइंसेज ऑफ चाइना, 2018, 25 (5): 1051-1058। Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430।

ईएचपी का पता मुख्य रूप से आणविक जीव विज्ञान विधियों पर निर्भर करता है, पीसीआर तकनीक सबसे आम है। हालांकि, जबकि पीसीआर उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है, इसके लिए महंगे पीसीआर उपकरण और एक विशेष प्रयोगशाला वातावरण की आवश्यकता होती है, जिससे यह क्षेत्र के उपयोग के लिए अनुपयुक्त हो जाता है। इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, अनुसंधान टीम ने MIRA प्रौद्योगिकी के आधार पर दो तेजी से पता लगाने के तरीके विकसित किए। ये विधियाँ उच्च संवेदनशीलता, त्वरित प्रतिक्रिया और आसान संचालन की पेशकश करती हैं, जो जटिल प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता के बिना चिंराट पर ईएचपी के कुशल और तेजी से पता लगाने को सक्षम करती हैं, इस प्रकार वर्तमान पता लगाने के तरीकों में अंतर को भरते हैं।

अध्ययन में प्रयुक्त प्रवर्धन अभिकर्मक:

• डीएनए इज़ोटेर्मल रैपिड प्रवर्धन किट (मूल)
• डीएनए इज़ोटेर्मल रैपिड प्रवर्धन किट (कोलाइडल गोल्ड स्ट्रिप प्रकार)

MiRA प्रौद्योगिकी एक बहु-एंजाइम इज़ोटेर्मल रैपिड न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन विधि है। इसके मुख्य सिद्धांत में तेजी से न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन को प्राप्त करने के लिए परिवेश के तापमान पर कई कार्यात्मक प्रोटीनों की समन्वित कार्रवाई शामिल है, जो वास्तव में पोर्टेबल, ऑन-साइट न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में सक्षम है।

तलाश पद्दतियाँ

नमूना निष्कर्षण

अनुसंधान टीम ने संक्रमित और स्वस्थ घास झींगा के नमूनों को एकत्र किया, जो कि लिआओनिंग प्रांत में तीन झींगा फार्मों से, झींगा के हेपेटोपेंसरस से डीएनए निकालते हैं।

प्राइमर डिजाइन

MIRA प्राइमरों के तीन सेटों को EHP के S8 सेरीन प्रोटीन जीन (जेनबैंक एक्सेस नंबर: 182063 पर) को लक्षित करते हुए डिज़ाइन किया गया था। इस जीन में अद्वितीय सक्रिय साइटें हैं, जो पता लगाने की विशिष्टता सुनिश्चित करती हैं।

मीरा-एज और मीरा-एलएफडी डिटेक्शन

(ए) अनुकूलित आरपीए-आयु प्रतिक्रिया तापमान। एम: डीएल 500 मार्कर; N: नकारात्मक नियंत्रण; उपभेदों 1-5: 25 डिग्री, 30 डिग्री, 37 डिग्री, 39 डिग्री, और 42 डिग्री।
(बी) अनुकूलित आरपीए-आयु प्रतिक्रिया समय। एम: डीएल 500 मार्कर; N: नकारात्मक नियंत्रण; 1: 10 मिनट; 2: 20 मिनट; 3: 30 मिनट; 4: 40 मिनट।
(C) अनुकूलित RPA-LFD प्रतिक्रिया तापमान। N: नकारात्मक नियंत्रण; 1: 25 डिग्री; 2: 30 डिग्री; 3: 37 डिग्री; 4: 39 डिग्री; 5: 42 डिग्री।
(D) अनुकूलित RPA-LFD प्रतिक्रिया समय। N: नकारात्मक नियंत्रण; 1: 5 मिनट; 2: 10 मिनट; 3: 20 मिनट।

दो मीरा का पता लगाने के तरीके, मीरा-एज (agarose जेल वैद्युतकणसंचलन) और miRA-LFD (कोलाइडल गोल्ड लेटरल फ्लो इम्युनोसे), का उपयोग EHP का पता लगाने के लिए किया गया था। अनुसंधान टीम ने प्रयोग के माध्यम से प्रतिक्रिया तापमान और समय को अनुकूलित किया। मीरा-एज ने लक्ष्य डीएनए को 30 मिनट में 37 डिग्री पर बढ़ाया, जबकि miRA-LFD ने 5 मिनट के भीतर पठनीय परिणामों के साथ 37 डिग्री पर केवल 10 मिनट में प्रवर्धन पूरा किया।

प्रायोगिक परिणाम

विशिष्टता और संवेदनशीलता

(ए) आरपीए-आयु का पता लगाने की विशिष्टता। एम: डीएल 1000 मार्कर; P: Nosema Bombycis; 1: एहप; 2: एन्सेफेलिटोज़ून; 3: माइक्रोस्पोरिडिया; 4: व्हाइट स्पॉट सिंड्रोम वायरस; 6: असामान्य; N: नकारात्मक नियंत्रण।
(B) RPA-LFD का पता लगाने की विशिष्टता। P: Nosema Bombycis; N: नकारात्मक नियंत्रण; 1: एहप; 2: एन्सेफेलिटोज़ून; 3: माइक्रोस्पोरिडिया; 4: व्हाइट स्पॉट सिंड्रोम वायरस; 6: असामान्य।
(C) पुनः संयोजक प्लास्मिड्स के ढाल dilutions के साथ RPA-ga की संवेदनशीलता। एम: डीएल 500 मार्कर; N: नकारात्मक नियंत्रण; 1: 4.7 × 10^5 प्रतियां/μl; 2: 4.7 × 10^4 प्रतियां/μl; 3: 4.7 × 10^3 प्रतियां/μl; 4: 4.7 × 10^2 प्रतियां/μl; 5: 4.7 प्रतियां/μl; 6: 4.7 प्रतियां/μl।
(D) पुनः संयोजक प्लास्मिड्स के ढाल dilutions के साथ RPA-LFD की संवेदनशीलता। N: नकारात्मक नियंत्रण; 1: 4.7 × 10^5 प्रतियां/μl; 2: 4.7 × 10^4 प्रतियां/μl; 3: 4.7 × 10^3 प्रतियां/μl; 4: 4.7 × 10^2 प्रतियां/μl; 5: 4.7 प्रतियां/μl; और 6: 4.7 प्रतियां/μl।

प्रयोगों ने प्रदर्शित किया कि MIRA प्रौद्योगिकी में उच्च विशिष्टता है, अन्य रोगजनकों पर प्रतिक्रिया किए बिना EHP का सटीक पता लगा रहा है। संवेदनशीलता के संदर्भ में, दोनों तरीकों में 4.7 प्रतियों/μl की पहचान सीमा थी, जो पारंपरिक पीसीआर की संवेदनशीलता से काफी अधिक थी।

नैदानिक ​​नमूना परीक्षण

30 नैदानिक ​​नमूनों के परीक्षण के परिणामों से पता चला है कि MIRA-age और miRA-LFD की सकारात्मकता दर 70%थी, जो QPCR के 80%से थोड़ा कम था, लेकिन पारंपरिक पीसीआर के 56.7%की तुलना में काफी अधिक है।

अनुप्रयोग संभावनाएँ

MiRA- आधारित पहचान के तरीके निरंतर तापमान पर लक्ष्य जीन के तेजी से प्रवर्धन के लिए अनुमति देते हैं। विशेष रूप से, miRA-LFD विधि जटिल प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता के बिना केवल 10 मिनट में परिणाम दे सकती है, जिससे यह झींगा फार्मों में साइट पर उपयोग के लिए आदर्श है। इस तकनीक की उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता इसे ईएचपी के शुरुआती पता लगाने और नियंत्रण के लिए एक कुशल उपकरण बनाती है, जिससे घास झींगा खेती उद्योग के स्वास्थ्य और विकास की रक्षा होती है।

इन विधियों में, कोलाइडल गोल्ड लेटरल फ्लो इम्युनोसे (miRA-LFD) विशेष रूप से अपनी सादगी और सहज परिणामों के कारण साइट पर अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। घास झींगा किसान ईएचपी संक्रमणों का जल्दी से पता लगा सकते हैं और उनका जवाब दे सकते हैं, रोग नियंत्रण क्षमताओं में सुधार कर सकते हैं, खेती की दक्षता को काफी बढ़ा सकते हैं, और आर्थिक नुकसान को कम कर सकते हैं।