वायरल न्यूक्लिक एसिड की ट्रेस मात्रा के लिए सिग्नल प्रवर्धन प्राप्त करने और Cas14a के लिए पर्याप्त सब्सट्रेट प्रदान करने के लिए, हमने MIRA पर आधारित aMIRA (असममित मल्टीएंजाइम इज़ोटेर्मल रैपिड एम्प्लीफिकेशन) विकसित किया है। परिणामी aMIRA-Cas14a प्रणाली निम्नलिखित प्रमुख लाभ प्रदान करती है:
1. अनुकूलित प्राइमर स्टोइकोमेट्री MIRA को अधिमानतः ssDNA का अधिक उत्पादन करने की अनुमति देता है, जो Cas14a के लिए प्रत्यक्ष सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है। फ़ॉरवर्ड{{3}से-रिवर्स प्राइमर अनुपात को 20:1 पर समायोजित करके, सिस्टम Cas14a की PAM{7}}स्वतंत्र क्लीवेज गतिविधि को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त ssDNA उत्पन्न करता है, जो विशेष रूप से ssDNA को पहचानता है और साफ़ करता है।
2. MIRA और CRISPR का एक-पॉट एकीकरण {{1}Cas14a क्रॉस-संदूषण जोखिमों को समाप्त करता है।
3. एमआईआरए पहचान संवेदनशीलता को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाता है, जिससे अल्ट्रा-लो-प्रचुरता वाले वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाना संभव हो जाता है।
4. aMIRA-Cas14a गैर-विशिष्ट प्रवर्धन के कारण होने वाली झूठी सकारात्मकताओं से बचते हुए, उच्च विशिष्टता बनाए रखता है।
अंततः, MIRA और CRISPR का वन-पॉट एकीकरण {{0}Cas14a संदूषण जोखिमों को समाप्त करता है और MIRA की शक्तियों और CRISPR {{2}Cas14a प्रणाली के बीच सही तालमेल प्राप्त करता है। यह इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन और सीआरआईएसपीआर सिस्टम के बीच असंगतता की उद्योग-व्यापी चुनौती को हल करता है, जो MaC14a प्लेटफ़ॉर्म की मुख्य तकनीकी सफलता का प्रतिनिधित्व करता है। AMIRA-Cas14a प्रणाली विशिष्ट प्रवर्धन सुनिश्चित करते हुए संवेदनशीलता में 1,000 गुना सुधार प्राप्त करती है। Cas14a की अनुक्रम-विशिष्ट पहचान के साथ संयुक्त, यह दोहरी-परत विशिष्टता सत्यापन प्रदान करता है, जिसमें गैर-लक्षित वायरस या स्वस्थ नमूनों के खिलाफ कोई क्रॉस-रिएक्टिविटी नहीं होती है {{13}अन्य उद्योग समस्या बिंदु को संबोधित करते हुए: झूठी सकारात्मकता की प्रवृत्ति।
इस अध्ययन में उपयोग किए गए एमआईआरए मल्टीएंजाइम इज़ोथर्मल रैपिड एम्प्लीफिकेशन अभिकर्मकों को एएमपी-फ्यूचर (चांगझौ) बायोटेक कंपनी लिमिटेड द्वारा प्रदान किया गया था। उत्कृष्ट अभिकर्मक प्रदर्शन के अलावा, एएमपी-फ्यूचर बायोटेक एक पेशेवर और तेजी से प्रतिक्रियाशील तकनीकी सहायता टीम भी प्रदान करता है।
MIRA अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए विकसित सेंट्रीफ्यूज-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ मजबूत अनुकूलता प्रदर्शित करता है:
1. लघु प्रतिक्रिया प्रणाली, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स की विशेषता वाले सूक्ष्म - वॉल्यूम प्रतिक्रिया कक्षों के लिए उपयुक्त;
2. एक ही बार में मल्टीप्लेक्स का पता लगाने की क्षमता;
3. पोर्टेबल उपकरणों के साथ संगतता, नमूने से परिणाम तक सुचारू कार्यप्रवाह।
हमने फ़ील्ड परिनियोजन के लिए अनुकूलित एक एकीकृत पोर्टेबल "सैंपल{{0}इन, आंसर{1}आउट" पॉइंट-ऑफ़{3}केयर टेस्टिंग (पीओसीटी) डिवाइस तैयार किया है, जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। कॉम्पैक्ट प्रोटोटाइप (23 सेमी (एल) × 21 सेमी (डब्ल्यू) × 14 सेमी (एच), 12.5 किलोग्राम कुल द्रव्यमान) असाधारण पोर्टेबिलिटी प्राप्त करता है। सिस्टम के मुख्य घटकों में सटीक घूर्णी नियंत्रण के लिए एक उच्च परिशुद्धता सर्वो मोटर और तापमान विनियमन के लिए एक वायु तापन इकाई शामिल है। चिप के नीचे स्थित एक एकीकृत ऑप्टिकल डिटेक्शन मॉड्यूल, प्रतिदीप्ति उत्तेजना और माप की सुविधा प्रदान करता है, जिससे पता लगाने में उच्च संवेदनशीलता और सटीकता सुनिश्चित होती है। पोर्टेबल डिवाइस एक एम्बेडेड एंड्रॉइड ऑपरेटिंग सिस्टम से लैस है, जो उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस की पेशकश करता है, जहां ऑपरेटर प्रतिक्रिया समय और तापमान जैसे विस्तृत पैरामीटर वाले प्रीप्रोग्राम्ड ऑपरेशन फ़ाइलों का चयन कर सकते हैं। परिणाम और निष्कर्ष वास्तविक समय में एलसीडी स्क्रीन पर प्रदर्शित होते हैं, जिससे तेजी से सूचना अधिग्रहण संभव होता है। इसके अतिरिक्त, सिस्टम में एक वायरलेस संचार मॉड्यूल शामिल होता है जो मोबाइल डिवाइस या क्लाउड सर्वर पर वास्तविक समय डेटा ट्रांसमिशन का समर्थन करता है, जो परीक्षण परिणामों की तत्काल व्याख्या और विश्लेषण के लिए कृत्रिम बुद्धिमत्ता एल्गोरिदम के साथ एकीकृत होता है।
