Cas12 गतिविधि का ट्यून करने योग्य नियंत्रण सार्वभौमिक और तेज़ पॉट न्यूक्लिक एसिड पहचान को बढ़ावा देता है
द्वारा प्रकाशित: चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय
जर्नल: नेचर कम्युनिकेशंस
प्रभाव कारक: 14.7
MIRA तकनीक का उपयोग करके, सोडियम हेपरिन पर आधारित एक सार्वभौमिक पॉट फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन विधि (सर्वेक्षण) विकसित की गई थी। अध्ययनों से पता चला है कि सोडियम हेपरिन Cas12a-crRNA बाइंडिंग प्रक्रिया में हस्तक्षेप करके Cas12a दरार गतिविधि को नियंत्रित कर सकता है। सोडियम हेपरिन सांद्रता को समायोजित करके, सर्वेक्षण क्लासिक और उप-इष्टतम PAM अनुक्रम दोनों के साथ संगत है और कई Cas12 उपप्रकारों पर लागू होता है। यह विधि, केवल 15{10}}20 मिनट के पता लगाने के समय के साथ, मंकीपॉक्स स्यूडोवायरस, इन्फ्लूएंजा ए वायरस और SARS-CoV-2 का पता लगाने के लिए 95% से अधिक संवेदनशीलता और विशिष्टता प्राप्त करती है। यह कम लागत वाला है और पारंपरिक सीआरआईएसपीआर डायग्नोस्टिक्स में संवेदनशीलता और विशिष्टता के बीच कठिन संतुलन को संबोधित करते हुए चिकित्सा क्षेत्र निदान और पर्यावरण निगरानी के लिए एक नई, पॉइंट-ऑफ-केयर डिटेक्शन विधि प्रदान करता है।
1. हेपरिन सोडियम की क्रिया के तंत्र पर अध्ययन
10nM लक्ष्य डीएनए वाले Cas12a-crRNA सिस्टम में एक फ्लोरोसेंट जांच जोड़ी गई थी, और सोडियम हेपरिन को शामिल किए बिना एक तीव्र और महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट सिग्नल देखा गया था। जब 0.2ug/ml सोडियम हेपरिन मिलाया गया, तो फ्लोरोसेंट सिग्नल नियंत्रण समूह के समान था, जो दर्शाता है कि सोडियम हेपरिन ने Cas12a{7%ug/mL सोडियम हेपरिन की ट्रांस{5}क्लीवेज गतिविधि को काफी हद तक बाधित कर दिया है, जो न्यूनतम निरोधात्मक सांद्रता है। जैसे ही सोडियम हेपरिन की सांद्रता 0.2ug/mL से बढ़कर 0.5ug/mL हो जाती है, Cas12a की सिस - क्लीवेज गतिविधि धीरे-धीरे बाधित हो जाती है, और 0.5 ug/mL पर, ट्रांस {{14} क्लीवेज गतिविधि लगभग पूरी तरह से बाधित हो जाती है। सोडियम हेपरिन की क्रिया के तंत्र पर अध्ययन से पता चला है कि सोडियम हेपरिन के नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए समूह Cas12a के साथ crRNA के सही बंधन में हस्तक्षेप करते हैं, और crRNACas12a बाइनरी कॉम्प्लेक्स के गठन को प्रभावित कर सकते हैं।
- एमआईआरए{{0}Cas12a एक-पॉट डिटेक्शन
सोडियम हेपरिन की क्रिया के तंत्र को मान्य करने के बाद, पेपर ने एक {{0}पॉट डिटेक्शन रणनीति (MIRA-Cas12a) का पता लगाया, जिसमें MIRA प्रवर्धन और Cas12a{{4}मध्यस्थ प्रतिदीप्ति पहचान को एक ही ट्यूब में संयोजित किया गया।
सोडियम हेपरिन की अनुपस्थिति में, MIRA -Cas12a संयोजन ने 0.1aM से 10fM की लक्ष्य जीन सांद्रता सीमा के भीतर कोई महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति संकेत उत्पन्न नहीं किया। 40µg/mL सोडियम हेपरिन पर, 1aM (≈0.6 प्रतियां/μL, आयतन=30μL) से 10fM (≈6,000 प्रतियां/μL, आयतन=30μL) की लक्ष्य सांद्रता सीमा में एक महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति संकेत देखा गया, जो सोडियम हेपरिन के बिना एक प्रणाली की तुलना में पहचान संवेदनशीलता में 10,000 गुना से अधिक सुधार दर्शाता है।
मंकीपॉक्स वायरस टेम्प्लेट सांद्रता 10 fM थी, और लक्ष्य जीन f31 और b6r का पता लगाने के लिए Cas12a-crRNA (100 nM) का उपयोग किया गया था। प्रवर्धन प्रतिक्रिया 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 और 20 मिनट पर समाप्त हो गई थी, और अलग-अलग समय पर एमआईआरए प्रवर्धन उत्पाद सामग्री का एगरोज़ जैल पर विश्लेषण किया गया था। इसके बाद परिणामी उत्पादों का तीन अलग-अलग सेटिंग्स के तहत अगारोज जैल पर विश्लेषण किया गया: MIRA {{16} हेपरिन सोडियम बिना Cas12a के, MIRA - Cas12a बिना हेपरिन सोडियम, और MIRA - Cas12a हेपरिन सोडियम के साथ। परिणामों से पता चला कि हेपरिन सोडियम की अनुपस्थिति में, Cas12a की उच्च सिस- क्लीवेज गतिविधि के कारण न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन में बाधा उत्पन्न हुई थी। हालाँकि, हेपरिन सोडियम के शामिल होने से Cas12a की सिस - क्लीवेज गतिविधि में कमी के कारण न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन में उल्लेखनीय वृद्धि हुई।
लेख दर्शाता है कि सोडियम हेपरिन पर आधारित एक सार्वभौमिक पॉट फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन विधि (सर्वेक्षण) क्लासिक पीएएम और सबऑप्टिमल पीएएम अनुक्रम दोनों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, LbCas12a के अलावा, AsCas12a और AapCas12b का भी CRISPR-Dx विधियों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। MIRA-AsCas12a का उपयोग करने वाले सिस्टम में, प्रतिदीप्ति केवल 40ug/mL सोडियम हेपरिन की उपस्थिति में देखी गई, जो दर्शाता है कि यह f31 और b6r जीन के 1fM का पता लगा सकता है। सोडियम हेपरिन की अनुपस्थिति में, MIRA-AapCas12b 1 f31 और b6r जीन का पता लगा सकता है। 20ug/mL सोडियम हेपरिन के प्रशासन ने न केवल MIRA-AapCas12b की पहचान दर को तेज किया, बल्कि प्रतिदीप्ति तीव्रता को भी बढ़ाया। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि सोडियम हेपरिन खुराक का उपयोग करके विकसित की गई एक -पॉट विधि अन्य Cas12 उपप्रकारों पर भी लागू होती है।
