《एक उपन्यास CAS13A/CAS12A की मध्यस्थता का विकास"एक-पॉट" दोहरी आनुवंशिक रूप से संशोधित फसलों एक्सप्रेस के लिए पता लगाने परख
आनुवंशिक रूप से संशोधित फसलों को दुनिया भर में व्यापक रूप से लगाया गया है, और कई देशों ने आनुवंशिक रूप से संशोधित फसलों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए धीरे -धीरे अपने नियामक उपायों में सुधार किया है। कृषि और जैव सुरक्षा के लिए तेजी से और सटीक ऑन-साइट जेनेटिक डिटेक्शन विधियों का विकास बहुत महत्वपूर्ण है, और आनुवंशिक रूप से संशोधित उत्पादों के बारे में सार्वजनिक चिंताओं को कम कर सकता है।
इस अध्ययन में, अनुसंधान समूह ने एक नई एक-पॉट प्रतिक्रिया -- miRA दोहरी पहचान विकसित की, जो कि आनुवंशिक रूप से संशोधित फसलों में CAMV35S और NOS आनुवंशिक लक्ष्यों के एक साथ पता लगाने के लिए दोहरी CRISPR (MR-DCA विधि) के साथ संयुक्त है, जो आनुवंशिक रूप से संशोधित क्रॉप्स के पहचान के लिए एक सरल और कुशल पता लगाने की विधि प्रदान करता है।
प्रयोगात्मक विधियों
MIRA दोहरी उत्पाद का विश्लेषण CAS13A और CAS12A दोहरी प्रणाली द्वारा दो स्वतंत्र संकेतों को उत्पन्न करने के लिए किया जाता है जो एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप नहीं करते हैं, और फिर फ्लोरोसेंट रंग को एक रोशनी उपकरण द्वारा या दो टी लाइनों के साथ एक परीक्षण पट्टी द्वारा पढ़ा जाता है ताकि दोहरी-चैनल रीडआउट प्राप्त किया जा सके। पूरी प्रक्रिया 35 मिनट से भी कम समय में पूरी हो जाती है, जिसमें 20 प्रतियों के रूप में कम पता लगाने की सीमा होती है।
(CAMV35S और NOS के MR-DCA का पता लगाने का सिद्धांत)
पूरे प्रयोग को तीन चरणों में विभाजित किया गया है: मीरा प्रवर्धन, CRISPR प्रतिक्रिया और परिणाम व्याख्या के दो तरीके।
CAMV35S जीन का उपयोग CAS13A के लक्ष्य के रूप में किया जाता है, और NOS जीन का उपयोग CAS12A के लक्ष्य के रूप में किया जाता है। MIRA प्राइमरों के दो जोड़े क्रमशः डिजाइन किए गए थे। CAS13A प्रणाली केवल RNA को पहचानती है, इसलिए आगे प्राइमर क्षेत्र को डिज़ाइन किया गया है, जिसमें बाद के प्रतिलेखन और CAS13A के सक्रियण के लिए एक T7 प्रमोटर होता है। एक पाम को एनओएस जीन में जोड़ा जाता है। उपरोक्त परिवर्धन यह सुनिश्चित करते हैं कि CAS13A और CAS12A प्रोटीन दोनों अपने संबंधित CRRNAs को बांध सकते हैं, और दो प्रणालियों के बीच कोई हस्तक्षेप या क्रॉस-रिएक्शन नहीं है।
प्रायोगिक स्थिति
संवेदनशीलता और विशिष्टता
नमूना miRA प्रतिक्रिया की प्रतिदीप्ति तीव्रता का परीक्षण करने के लिए एक ढाल में पतला था। यह पाया गया कि प्रतिदीप्ति तीव्रता को अभी भी 20 μL के नमूना एकाग्रता पर पता लगाया जा सकता है। 20 μL की एकाग्रता को अंततः प्रयोग के लिए चुना गया था।
(विभिन्न नमूना सांद्रता और परीक्षण स्ट्रिप्स का उपयोग रंग विकास और तीव्रता मात्रा निर्धारण गणना के लिए किया जाता है)
एमआर-डीसीए की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, अनुसंधान टीम ने गैर-ट्रांसजेनिक जानवरों और गैर-ट्रांसजेनिक पौधों के मिश्रित नमूनों का परीक्षण किया। परिणामों से पता चला कि केवल CAMV35S और NOS युक्त ट्रांसजेनिक नमूनों में उच्च प्रतिदीप्ति संकेत थे, जबकि अन्य नमूनों की प्रतिदीप्ति तीव्रता नकारात्मक नियंत्रण के करीब थी। एमआर-डीसीए का उपयोग एक विशिष्ट दोहरे लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन प्लेटफॉर्म के रूप में किया जा सकता है।
एमआर-डीसीए द्वारा 24 फसल के नमूनों का परीक्षण किया गया। उनमें से, 1, 2, 15, 16, 21, और 22 ट्रांसजेनिक कॉर्न हैं जिनमें CAMV35S प्रमोटर हैं। 7, 8, 23, और 24 रोग-प्रतिरोधी ट्रांसजेनिक चावल हैं जिनमें एनओएस टर्मिनेटर होता है। 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17, और 18 ट्रांसजेनिक सोयाबीन हैं जिनमें CAMV35S प्रमोटर और NOS टर्मिनेटर हैं।
(24 नमूनों का परीक्षण परिणाम)
तीव्र प्रतिक्रिया
प्रतिक्रिया समय ऑन-साइट का पता लगाने में एक महत्वपूर्ण कारक है। अनुसंधान टीम ने देखा कि एफएएम और हेक्स के प्रतिदीप्ति संकेतों को एक प्रतिदीप्ति उपकरण द्वारा पता लगाया जा सकता है जब प्रतिक्रिया समय 10 मिनट था। CRISPR प्रतिक्रिया के साथ संयुक्त मीरा ने भी 15 मिनट के बाद पीले प्रतिदीप्ति का अवलोकन किया।
(विभिन्न miRA प्रतिक्रिया समय पर प्रतिदीप्ति संकेत)
(अलग -अलग miRA प्रतिक्रिया समय और तीव्रता मात्रा निर्धारण गणना पर परीक्षण स्ट्रिप्स का रंग विकास)
प्रायोगिक निष्कर्ष
प्रायोगिक परिणामों से पता चला कि दोहरी miRA में अच्छी विशिष्टता है और यह CAMV35S और NOS के प्रवर्धन उत्पादों को सटीक रूप से प्राप्त कर सकता है। CAS13A और CAS12A सिस्टम एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप किए बिना स्वतंत्र रूप से प्रतिक्रिया करते हैं। एमआर-डीसीए परीक्षण 35 मिनट के कम तापमान पर 20 प्रतियों का सही पता लगा सकता है, जिसका क्षेत्र में आनुवंशिक रूप से संशोधित फसलों का पता लगाने में बहुत मूल्य है।
लेख सूचना
जर्नल का नाम:। एडवांस्ड रिसर्च एक्सप्रेस के जर्नल
अनुच्छेद शीर्षक: 《एक उपन्यास CAS13A/CAS12A की मध्यस्थता "वन-पॉट" दोहरी पहचान परख आनुवंशिक रूप से संशोधित फसलों के लिए विकास
प्रभाव कारक: 11.4
अनुसंधान टीम: वांग जियाओफू, ज़ेजियांग एकेडमी ऑफ एग्रीकल्चर साइंसेज